A transesterificação pode ser conduzida na presença de catalisadores ácidos, básicos e enzimáticos, simples ou complexos. O emprego de catalisadores ácidos, dentre os quais o ácido sulfúrico é o mais empregado, leva a cinética muita lenta de reação quando comparada ao uso de catalisadores básicos.
Outro inconveniente do uso de catalisadores ácidos encontra-se na necessidade de sua remoção visando a prevenir possíveis danos às partes integrantes dos motores. A catálise básica por sua vez é muita rápida, geralmente em 15 minutos o estado assintótico é alcançado. E leva a excelentes rendimentos, muitas vezes superiores a 90%.
Contudo, o emprego de catalisadores básicos apresenta como inconvenientes a grande sensibilidade à presença de água e ácidos graxos livres, que mesmo em teores bastante reduzidos afetam o rendimento da reação, consomem o catalisador e levam à formação de géis e sabões.
Tais exigências dificultam a utilização de óleos usados de frituras, cujo teor de ácidos graxos normalmente ultrapassam o índice 2 de acidez. Além disso, a separação do biodiesel do restante reacional é uma tarefa complexa e exige várias etapas de separação e neutralização, para atingir a especificação correta.
Os separadores centrífugos para a separação da glicerina parecem ser os mais recomendados. Um dos parâmetros mais importantes na especificação do biodiesel é exatamente o teor máximo de glicerina, de 0,5% na proposta brasileira, e de 0,25% nas normas americanas e européias, que deve ser baixo para evitar a formação de depósitos na câmara de combustão, e a produção de teores elevados de acroleína nos gases de escapamento.
O emprego de enzimas como catalisadores oferece vantagens frente aos catalisadores ácidos e básicos, como a menor sensibilidade à presença de água, recuperação do catalisador e separação do biodiesel. No entanto, apresenta altos custos. Esta tecnologia vem sendo estudada no Brasil desde os anos 80.
Em 1984, obteve-se uma patente relativa ao uso de guanidinas suportadas por polímeros orgânicos. Contudo, encontra-se ainda em fase de desenvolvimento e é um objeto de intenso esforço de pesquisa, podendo em médio prazo constituir-se em uma alternativa interessante.